抗體類藥物的研發日益增多，為了確保這些分子質量屬性的準確描述，需要采用復雜的技術手段。質譜（MS）由于其優于目前現有分析技術的結構分辨能力，已經成為治療性抗體研發的幾乎必備的分析工具。質譜廣泛應用于抗體研發的各個階段，包括克隆選擇、細胞培養過程開發、純化過程開發、制劑開發、穩定性研究和可比性研究。質譜確定的結構特征包括氨基酸序列、二硫鍵位置、碳水化合物結構和特征以及許多不同的翻譯后、過程中和貯存中的修飾。
在本綜述中，我們將討論用于單克隆抗體（mAbs）結構表征的各種基于質譜的技術。在討論mAbs結構表征策略之前，有必要定義本文中使用的一些術語。通過質譜表征蛋白質的結構變異或修飾時，完整分子的質量測量可以呈現出整個蛋白質的一般特征，但不能提供變異或修飾的位置。換句話說，完整分子的質量測量并不能提供任何結構分辨信息。為了獲得結構分辨的信息，需要在進行質量分析之前將蛋白質切割成較小的片段。這種切割過程可以在溶液中或氣相中進行。當片段主要在溶液中生成時，質譜儀用于分析每個片段，分子根據從這些片段獲得的信息構建：我們稱這種方法為“up”類型方法。另一方面，當片段主要在質譜儀內的氣相中生成時，質譜儀用于直接分析整個分子，我們稱這種方法為“down”類型方法。
“up”和“down”方法進一步分為“bottom-up”、“middle-up”、“top-down”和“middle-down”方法亞型。方法亞型取決于引入質譜儀的分子大小相對于完整分子的大小。當直接將感興趣的完整分子引入質譜儀時，該方法是“top-down”的方法。當蛋白質在引入質譜儀之前被切割成幾個大片段時，如果直接測定這些片段的質量，則該方法是“middle-up”的方法；如果在質譜儀內進行進一步的片段化，則為“中間向下”的方法。當蛋白質在引入質譜儀之前被消化成小肽時，該方法是“middle-down”的方法。當蛋白質在引入質譜儀之前被消化成小肽時，該方法稱為“bottom-up”方法，無論這些肽是否進行MS/MS。這些技術在結構分辨率、序列覆蓋率、樣品消耗和分析便利性方面各有優缺點。將這些方法應用于mAbs結構表征的總結如圖1所示，將在以下章節中詳細討論。
(相關資料圖)
圖1: 不同的基于質譜的技術用于單克隆抗體的結構表征
02基本概念2.1儀器分辨率
質量測量的質量取決于質譜儀的分辨率和質量準確性。高分辨率的儀器可以分辨質量稍有不同的分子，使它們的質量能夠分別確定，而不是作為加權平均值合在一起。所有天然產生的蛋白質都具有普遍的質量異質性，這來自不同分子的不同同位素組成以及復雜發翻譯后修飾。如果質譜儀具有足夠的分辨率，那么這些同位素峰可以分辨，每個個體同位素組成的質量可以確定。在這些同位素峰中，單一同位素峰是最重要的，因為它是唯一具有獨特同位素組成的峰。然而，對于如mAb這樣的大型蛋白質，單一同位素峰是不可觀察的，同位素分布如此廣泛，以至于難以確定每個同位素峰中包含多少重穩定同位素。因此，同位素峰的精確質量用途有限。此外，對于像mAb這樣大的蛋白質，同位素峰很難分辨。由于儀器分辨率與儀器靈敏度之間通常存在折衷，因此評估質量測定完整mAb的最佳分辨率是有幫助的。圖2顯示了一個典型的mAb（元素組成為C6600H10172N1738O2103S52）的模擬同位素分布作為分辨率（R=M/DM）的函數。可以看出，當分辨率在8000以上時，同位素包絡峰寬度沒有顯著改變。盡管當分辨率達到200000時，同位素峰開始分辨，但它們的精確質量提供的信息很少，而且在這種高分辨率下，靈敏度會受到影響。因此，最佳分辨率約為8000-10000。分辨率在10000以上通常不會有助于分辨任何mAb異質性。在自然峰寬（半高處）達到25 Da的情況下，很難分辨出質量變化較小的異質性，如氧化（+16 Da），而用任何儀器幾乎不可能分辨出脫酰胺（+1 Da
圖2：典型單克隆抗體元素組成為C6600H10172N1738O2103S52，不同分辨率（R=M/ΔM）的模擬同位素分布。
2.2 質量準確度在一個分子的許多同位素峰中，單一同位素峰是唯一具有單一同位素組成的峰，因此具有唯一確定的理論質量。因此，在評估較小分子質量測定的準確性時，通常只使用單一同位素峰。然而，對于像mAb這樣的大分子，同位素峰極難分辨。即使同位素峰被分辨出來，由于單一同位素峰的豐度幾乎為零，無法可靠地確定單一同位素質量。因此，必須使用抗體的平均質量來確認其元素組成。事實上分子的平均質量受到組成該分子的元素的同位素豐度的影響。例如，在重組mAb的生產過程中，哺乳動物（CHO）細胞被喂養20種氨基酸和一些其他營養物質，這將確定產出抗體中的同位素豐度。因為不同元素的同位素豐度主要取決于它們的來源，因此，應該使用不同來源的元素的原子量來計算不同來源化合物的平均質量。表1顯示了蛋白質中元素的IUPAC標準原子量和范圍。表1中還顯示了根據有機物中這些元素的同位素豐度估計的原子量及其范圍。在計算天然蛋白質的理論質量時，最好使用有機來源元素的原子量，因為它們是這些分子中元素的主要來源。例如，對于元素組成為C6600H10172N1738O2103S52的mAb，其理論質量根據IUPAC標準原子量計算為149181.15 Da。但是，當使用根據有機來源估計的原子量時，計算出的理論質量為149181.89 Da。這個差異（0.74 Da）相當于mAb的理論平均質量差異為5.0 ppm。由于大自然中同位素豐度的變化，蛋白質的平均質量很容易因為幾ppm而發生變化。例如，碳的原子量變化0.00008 Da（C3代謝過程的陸生植物范圍的一半）會導致相同的mAb分子質量差異為0.53 Da（3.5 ppm）。類似地，其他元素的變化也會導致分子平均質量的低ppm差異（氫為1.6 ppm，氮為1.7 ppm，氧為1.3 ppm，硫為1.0 ppm）。總體而言，由于天然同位素豐度的變化，mAb的平均質量變化范圍在3-5 ppm左右，前提是使用表1右列的有機來源元素的平均原子量。表1：常見原子不同來源的質量數因此，測量mAb質量的關鍵因素包括儀器分辨率和質量準確性。對于大型蛋白質如mAb，最佳分辨率約為8000-10000，分辨率在10000以上通常不會有助于分辨任何mAb異質性。質量準確度對于識別不同修飾和異質性也至關重要。理想情況下，蛋白質質量的測定應具有足夠高的準確性，接近于天然同位素豐度變化所致的平均質量變化，從而有助于準確評估蛋白質的組成和可能的修飾.
近年來，飛行時間質譜（TOF）已在質量準確性（2-10 ppm）、分辨率（5,000-20,000）和最大m/z（高達10,000）方面取得了顯著成果。當分析儀配備ESI時，這些特點非常適合測定完整mAbs的質量。
早期嘗試使用ESI-TOF進行完整mAb質量分析的研究受到了當時儀器性能的限制。隨著ESI和TOF技術的不斷改進，ESI-TOF和ESI-Q-TOF已被廣泛認為是分析大分子蛋白質（如mAbs）質量的標準儀器。
在ESI-TOF儀器上，使用每日外部校準，測定完整mAbs質量的質量準確性通常低于100 ppm。通過仔細執行實驗，可以將完整mAb的質量準確性測定為25-50 ppm。在實驗條件下優化以減少加合物形成，實驗前進行校準，并嚴格控制去卷積參數，部分實驗室可以實現接近10 ppm的質量準確性。
TOF通常可提供的最高分辨率比Orbitrap 和FTICR MS 低幾倍，盡管最近的多通道TOF 分析儀能夠實現超高分辨率（在m/z 400 處，R≥100000）。同時，TOF的分辨率在MS 和MS/MS 模式下基本相同，這在形式上是對Orbitrap 分析儀的一個優勢，因為Orbitrap 在MS/MS 模式下常常為了速度而犧牲分辨率。然而，在實際應用中，TOF在MS/MS 模式下的較高分辨率并不一定能夠轉化為更高的質量精度（這通常是最理想的分析參數），因為TOF 的傳輸效率受到限制。因此，與TOF 相比，在類似的實驗中，Orbitrap質譜儀實際報告的真正陽性識別率可能更高。
峰值檢測限由信號/噪聲比確定，由于檢測器的暗電流、漂移離子以及“化學”背景離子的存在，TOF的噪聲會增加。這些非共價的復合物由分析物離子、溶劑和有時還有氣態分子組成，其電荷通常來自于質子以外的堿金屬和其他附加物。這些非共價復合物在每個m/z單位處產生寬而模糊的峰，其峰谷由類似來源的多帶電離子和其亞穩解離產物填充。這種化學背景的存在通常是限制TOF儀器檢測閾值和動態范圍的主要因素。有點諷刺的是，使用FT分析器（包括FTICR和Orbitrap）獲得的質譜圖幾乎不含有化學背景。這種現象的可能解釋是，要被檢測到（即使是在錯誤的m/z處），背景離子只需要進入TOF分析器，之后就可以由于碰撞而解離或偏離其路徑，而這兩個事件都不會顯著影響檢測概率。同時，在FT質譜圖中產生一個尖銳的、軟件識別的峰，需要離子在FT分析器內保持完整的、相干的運動狀態與類似離子共存達到較長的時間，即多毫秒的時間。所有偏離軌道、亞穩的或不相干的離子要么不會被FT檢測到，要么會貢獻于寬闊、平滑的背景信號，這些信號可以很容易地被軟件減去。因此，盡管TOF的靈敏度形式上更高，但FT分析器的真實檢測極限可能是可比或更低的。
Orbitrap Orbitrap質譜是近期新增的分析工具之一，由Alexander Makarov發明。Orbitrap質譜儀由一個同心的中央電極和一個桶狀電極組成，并在兩個電極之間施加靜電場。注入靜電場的離子被兩種力約束；靜電場抵消離心力場，并使離子在中心電極上軸向和徑向運動。軸向的諧振頻率應用于m/z測量，因為這種振蕩模式與離子能量無關。外部電極上的圖像電流用于檢測。
質量分辨率取決于采集時間（更具體地說是諧振次數），因此更高的質量分辨率需要較長的采集時間，可實現m/z=400處的200,000的質量分辨率，這比大多數TOF儀器高得多(PS:廣告詞而已，m/z=400在抗體分析中并不是一個典型的質荷比，分辨率隨著m/z的上升會隨之下降，可以見下圖，單方面強調廣告級別的分辨率并沒有太大意義。PS的PS: Thermo打錢我就刪，當然Orbitrap的性能包括易維護性確實比TOF好)。
Orbitrap與FTICR的分辨率與m/z的關系（所有數據均顯示為0.76秒掃描）
商業上，Orbitrap質譜儀通過C-trap與線性離子阱相耦合。C-trap的作用是在進入Orbitrap質譜儀的入口處電動擠壓離子以收斂。線性離子阱和Orbitrap質譜儀可以分別或組合使用。例如，在分析模式下，Orbitrap可以執行質量分析，而離子阱用于接口離子源，連續傳輸離子并定期將離子引入Orbitrap。兩者可以同時操作，其中在Orbitrap中執行質量分析，而在線性離子阱中執行MS/MS或MSn碎片實驗并進行質量分析。
03結構表征3.1Middle-UP的結構表征
雖然測定完整mAbs的質量可以給出蛋白質的整體表示，但它不能提供任何結構分辨率。要獲得結構分辨信息，必須在質量分析之前將蛋白質切割成更小的片段。另一種方法，稱為“Middle up”方法，包括在質譜分析之前將蛋白質（mAbs）切割成幾個大片段。將mAb切割成幾個大片段的一種方便方法是還原二硫鍵以生成重鏈和輕鏈。對單個鏈的質量分析可用于確認每個鏈的結構，或者定位每個單獨鏈中的變體或修飾。
完全還原所有二硫鍵可以在變性條件下進行還原。在沒有變性劑的情況下，可以選擇性地還原鏈間二硫鍵，使鏈內二硫鍵保持完整。這種簡單的還原方法已被用于確認mAb結構，表征抗體結構，確定輕鏈和重鏈上的不同修飾，并檢查重鏈上的糖基化結構。
另一種常見的中間向上方法是在天然條件下用蛋白酶（如木瓜蛋白酶，胃蛋白酶）對mAbs進行處理。對于許多IgG類分子，這些有限消化的切割位點通常在鉸鏈區附近，生成Fab、F(ab)2和Fc片段。然而，IgG2分子在天然條件下抵抗酶解。這些通過酶生成的片段還原后會產生更小的片段。這些片段的質量分析提供了比完整mAb質量測量更詳細的結構信息。與還原方法類似，有限消化方法已被用于確認mAb結構，識別翻譯后或化學修飾，以及表征抗體結構。
與完整的mAbs相比，這些片段要小得多，因此更容易分析，可能在不太理想的儀器上具有更高的質量準確度。例如，對于IgG1分子，重鏈質量約為51 kDa，輕鏈23 kDa，Fc 53 kDa，單鏈Fc 26 kDa，Fab重鏈（Fd）24 kDa，Fab 48 kDa，F(ab)2 96 kDa，相較之下，完整的IgG1質量為150 kDa。由于要分析的分子尺寸顯著減小，而且大多數片段不受糖基化異質性影響，因此減少了質譜儀的質量范圍和分辨率要求。因此，這些片段可以在大多數儀器上進行分析，如四極桿或離子阱，盡管ESI-TOF/Orbitrap仍然是首選方法。
通過有限消化和/或還原產生的片段通常通過RP-HPLC分離，并與ESI-MS在線分析。例如，將DTT還原或木瓜蛋白酶消化應用于IgG1分子，然后進行RP-HPLC/MS分析，以表征和定量諸如焦谷氨酸環化、脫酰胺化、天冬酸異構化和氧化等多種修飾。還原或消化后，RP-HPLC上的亞結構分離良好。圖3顯示了木瓜蛋白酶消化后的IgG1進行質譜分析的總離子色譜圖。圖中還展示了峰5-7的質譜峰。從確定的質量可以明顯看出，峰5是具有不同糖基的Fc區域，峰6是氧化的Fc區域，峰7是具有去酰胺的Fc區域。峰1-4被確定為Fab區域的不同形式，包括焦谷氨酸環化和脫酰胺（未顯示在圖中）。
圖3
Middle up分析提供了一種簡單的方法，將結構變化定位到分子的特定區域。這種方法具有一定程度的結構分辨率，但無法將變化定位到特定的氨基酸殘基。這種方法對于確定抗體中結構變化的位置非常有用，但對于確定結構變化發生在哪個具體氨基酸上，則需要更高分辨率的方法。
3.2 BOTTOM-UP的結構表征
要確認蛋白質序列或在殘基水平上表征修飾，最常用的技術是bottom up的方法。在bottom up的方法中，蛋白質被蛋白酶消化成小肽，然后進行LC/MS，或更常見的LC/MS/MS分析。蛋白水解與LC/MS/MS分析相結合，提供了高結構分辨率，但在質譜分析中，它通常是最耗材料、耗時且勞動密集的。消化過程中的假陽性，包括易失修飾如琥珀酰亞胺的丟失，以及氨基酸重排，可能導致錯誤的結論，因此需謹慎處理。bottom up廣泛用于確認蛋白質序列，表征翻譯后、過程中和貯存中的修飾，以及表征二硫鍵連接。
A.蛋白水解通常在變性條件下對mAb進行還原和烷基化后，使用胰蛋白酶或Lys-C進行蛋白水解。其他不太常用的蛋白酶包括Glu-C（V8）和Asp-N。化學切割方法，如氰酸溴（CNBr）消化，也偶爾會使用。
以上所有方法通常將蛋白質切割成適當大小的肽，這些肽在MS/MS實驗中能有效地片段。需要注意的是，在大多數商用儀器上，大肽（>4 kDa）很難通過MS/MS表征，而非常小的肽（2-3個殘基）通常由于在反相柱上的保留不佳而丟失。
B. LC/MS和 LC/MS/MS 在早期，MALDI-TOF儀器廣泛用于測定從mAb和其他蛋白質的蛋白水解產生的肽的質量，用于結構確認和異構體/修飾分析。與ESI-MS相比，MALDI-TOF具有易用性，且耗材和時間較少的優點。然而，由于LC串聯的便利性和肽鑒定所需的串聯質譜質量較好，目前大多數在mAb上進行的自下而上實驗都是在ESI儀器上進行的。
在LC/MS/MS肽圖實驗中，困難通常出現在mAb的蛋白水解上。通常需要大量的蛋白質材料才能獲得成功的消化。只要實現完全消化，由于現代儀器的顯著進步，MS檢測的靈敏度通常不是問題。因此，大多數LC/MS/MS肽圖實驗是在小孔徑RP-UPLC柱上進行，以獲得最佳的色譜分辨率。
C.二硫鍵確定要確定蛋白質內的二硫鍵連接方式，必須在二硫鍵仍然完整的情況下進行消化。在普通條件下，單克隆抗體分子非常穩定并且難以消化，因此單克隆抗體內的二硫鍵連接方式的表征具有挑戰性。成功的消化關鍵在于在強性變性條件下使單克隆抗體變性，例如6M鹽酸胍和高溫。重要的是，在變性過程中必須存在烷基化試劑，如碘乙酸（IAA），碘乙酰胺（IAM）或N-乙基馬來酰亞胺（NEM），阻止單克隆抗體中所有存在的自由巰基組來防止二硫鍵雜化。由于其在較低pH下的活性，通常優先使用NEM。消化前必須稀釋變性劑以保留蛋白酶的活性。消化通常使用胰蛋白酶或Lys-C。隨后，一部分樣品會將使用DTT或者TCEP進一步還原二硫鍵，并將LC / MS / MS肽圖與未還原圖進行比較以確定二硫鍵連接。靠近鉸鏈區域的二硫鍵通常使用Edman測序或者使用TCEP在弱酸性下在NEM or M-biotin存在的條件下部分還原檢測。
另一個用于確定mAb中二硫鍵的有用方法是在負離子模式下通過LC/MS分析非還原消化物。在負離子模式下，二硫鍵通常被有效地斷裂，以顯示通過二硫鍵連接的鏈。這種方法可以被視為在氣相中的二硫鍵還原。
治療性抗體的二硫鍵結構通常必須經過確認，以確保抗體被正確制備和折疊。大多數重組的單克隆抗體確實顯示出與預期結構一致的二硫鍵結構，除了IgG2分子。有證據表明，重組和自然發生的IgG2分子中存在二硫鍵的異質體。當在非還原條件下消化重組的IgG2分子時，觀察到一些后期洗脫的RP-HPLC峰。這些峰的質譜分析以及這些峰的收集和還原形式的質譜分析表明，它們是二硫鍵連接的肽；所有這些肽都涉及連接到輕鏈恒定區和/或CH1域的鉸鏈區。這個結果表明，在IgG2分子中存在二硫鍵變異體。這些二硫鍵變異體可以通過離子交換和反相色譜分離，并且它們在全血或“血液樣”環境中相互轉化。進一步的研究表明，這些二硫鍵變異形式也存在于人骨髓瘤IgG2和人血清多克隆抗體中。
3.3 TOP-DOWN結構表征
盡管bottom up的方法提供了最多的結構信息，但是它們需要大量的人力，而且常常存在一些問題，比如需要消耗大量樣品，消化過程中可能會引入人為因素，以及樣品制備需要花費很長時間。對于數量或濃度有限的樣品，例如從色譜分離中獲得的微量組分，需要進行多次收集和濃縮才能獲得足夠的材料進行成功的酶解。在這種情況下，top-down和middle-down成為提供有用序列信息的非常快速和方便的選擇。
Top-down質譜法是指將完整分子引入質譜儀，而不進行溶液中的酶解或化學分解，并通過分析分子在質譜儀內的裂解模式來獲得結構信息。自上而下的質譜法可成功地快速表征小到中等大小的蛋白質。由于產生的高度帶電的碎片離子數量龐大，因此通常需要高分辨質譜儀進行top-down的質譜分析。通常來說，可以通過儀器分辨率來確定可用自上而下質譜法分析的蛋白質大小。例如，分辨率為10,000的Q-TOF型儀器應該可以為重量達到10,000 Da的蛋白質提供大量的結構信息。對于更大的蛋白質，首選具有更高分辨率的儀器，如傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR MS）或Orbitrap
圖4展示了當在Thermo-Fisher LTQ-Orbitrap上分析IgG2分子時的in-source fragmentation圖譜。除了小的N末端輕鏈碎片和小的N末端和C末端重鏈碎片以及一些內部碎片離子外，一個相當引人注目的觀察結果是存在一系列大離子，這些離子的存在表明在重鏈的b106到b118離子和輕鏈的b114到b118離子之間存在一些結構信息。這些N末端碎片對應于重鏈和輕鏈的整個可變區域。可以對這些b離子進行MS/MS以獲得有關可變區域更詳細的結構信息。
圖4：一種IgG2分子in-source fragmentation質譜圖。完整的圖譜顯示在頂部。底部顯示了從m/z 1,500到1,850的圖譜。主要的碎片離子用帶電荷的b或y離子標記。前綴H代表重鏈，L代表輕鏈。Top-down的質譜法消耗的材料很少，可以在很短的時間內提供有用的結構信息。當與在線液相色譜/質譜法相結合時，in-source fragmentation的完整mAb可以在沒有任何樣品制備的情況下提供有用的可變區域以及末端區域的結構信息。
自上而下的質譜法用于大蛋白質（如mAb）的主要缺點是通常具有有限的結構分辨率。對于IgG1和IgG2分子，只能獲得可變區域和末端附近的信息。在大多數情況下，機緣巧合仍然是決定實驗結果的重要因素。如果感興趣的修飾位點位于富含序列信息的區域，則可以準確地確定修飾位點。在其他情況下，如果修飾位點位于序列信息較少的區域，則可以將修飾位點分配給蛋白質的一個較大的片段，但無法指定特定的氨基酸殘基。
3.4 MIDDLE-DOWN結構表征
Middle down可能是解決自top down中結構分辨率有限問題的一種有價值的替代方法。在middle down中，蛋白質首先通過還原二硫鍵或者有限的蛋白酶水解作為中間步驟分成幾個大片段，然后再被引入質譜儀進行MS/MS分析。與top down相比，middle down可以在一些有限的樣品制備情況下潛在地提高結構分辨率。由于中等質量實驗中所采用的還原二硫鍵是化學反應，可以使用大量的化學試劑來實現，因此它不像酶反應那樣有樣品濃度的要求，因為酶反應通常不使用大量的酶（貴貴貴貴啊）。因此，對于稀釋的少量樣品，middle down實驗比top down更有優勢。
圖5顯示了一種IgG2分子的輕鏈和重鏈的CID MS/MS譜圖，該譜圖是在Thermo LTQ-Orbitrap上獲得的。Orbitrap的超高分辨率和質量精度可確保片段離子的準確鑒定。通過MassAnalyzer的分配和手動驗證，根據準確測定的質量、同位素模式和一些片段化規則，大多數片段離子可以分配為b、y或其他片段。根據這些分配，輕鏈中213個肽鍵中有59個被切割，重鏈中447個肽鍵中有67個被切割；這些數據對應于輕鏈的平均結構分辨率（通過將肽鍵的總數除以被切割的肽鍵數來計算兩個切割位點之間的平均殘基數）為3.6個殘基，重鏈為6.7個殘基。
圖5
04未來展望直到最近，幾乎所有的mAb結構表征都是通過bottom-up方法實現的。雖然bottom-up方法越來越成熟，但是top-down和middle-down方法仍處于發展初期。然而，top-down/middle-down方法的優點，如最小樣品操作和快速反應時間，使得這些技術非常有吸引力。雖然并不是所有的結構問題都能用top-down或middle-down方法解決，但許多問題可以在幾個小時內解決，而不是像"up"方法一樣需要幾天時間。top-down/middle-down方法沒有被廣泛接受的主要原因之一是它們需要高分辨率的儀器。然而，現代高分辨率儀器，如FT-ICR和Orbitrap，正在變得更加用戶友好，并且這些高端儀器正逐漸放到工業MS用戶手中。 當表征蛋白質異構體或修飾時，"bottom-up"方法將逐漸成為輔助方法，只有在"top-down"或"middle-down"實驗失敗時才會使用。電子俘獲解離（ECD）在蛋白質結構分析的"up"和"down"方法中具有巨大潛力。然而，由于使用難度大，需要FT-ICR儀器，因此它并沒有成為蛋白質化學家的主要工具。然而，最近開發的電子轉移解離（ETD）技術被廣泛應用于離子阱儀器中。此外，在Orbitrap上實現ETD使得對更大的肽段進行結構分析成為可能，并且對于middle-down實驗來說成為了理想的選擇。參考文獻：Roman A. Zubarev and Alexander Makarov.Orbitrap Mass Spectrometry. doi.org/10.1021/ac4001223
Zhongqi Zhang, Hai Pan, and Xiaoyu Chen. Mass spectrometry for structural characterization of therapeutic antibodies. DOI 10.1002/mas.20190
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